Kategorie

Populární Příspěvky

1 Embolie
Cévní systém v těle, jeho hlavní funkce. Klasifikace plavidel.
2 Leukémie
ALT a AST
3 Embolie
Co krevní tlak 140 až 70 znamená: příčiny a nebezpečí
4 Cukrovka
Příčiny krvácení z nosu, první pomoc a léčba
5 Vaskulitida
Extrasystole s menopauzou - příznaky, léčba
Image
Hlavní // Cukrovka

Imunologická imunoanalýza s rozpisem indikátorů


Vývoj moderní medicíny ve světě diagnostiky nepřestává ohromovat jeho úspěchy a nyní lékař nemusí dělat předpoklady o pravděpodobné diagnóze, spoléhat se pouze na nepřímé příznaky. Vytvoření a zavedení enzymatického imunosorbentového testu (ELISA) do světa laboratorních studií vám umožní rychle a přesně určit nejen přítomnost patogenu, ale také mnoho dalších charakteristik nemoci..

Historie vzniku a vývoje IFA

Tato metoda krevního testování se začala používat v praktické medicíně v polovině minulého století - někde v 60. letech. Jeho počátečním cílem byl vědecký výzkum v oblasti histologie, který byl omezen na vyhledávání a studium buněčné antigenní struktury biologických druhů. Krevní test ELISA je založen na interakci příbuzných antigenů (AG) a specifických protilátek (AT) s tvorbou komplexu "antigen-protilátka", stanoveného enzymem.

Tento jev vedl vědce k rozhodnutí, že tuto metodu lze použít k rozpoznání proteinových sloučenin různých tříd tvořených v krevním séru, když patogen vstoupí do těla. Díky jejich přímému zapojení do fungování imunitního systému se tyto sloučeniny nazývají imunoglobuliny (IG, Ig) a objev byl největším průlomem v laboratorní diagnostice..

Zároveň začali tuto vysoce citlivou metodu aktivně používat až v 80. letech a byla dostupná pouze ve vysoce specializovaných zdravotnických zařízeních. Úplně první, kdo dostal příležitost použít analyzátory enzymatických imunotestů, byla transfuzní centra a centra pro transfuzi krve, venereologická a infekční lékařská zařízení. Bylo to kvůli rychlému šíření „moru XX. Století“ - AIDS a bylo nutné bezodkladně přijmout diagnostická a terapeutická opatření..

Vlastnosti metody

Rozsah krevního testu na ELISA je poměrně široký - v tuto chvíli není možné si představit, jak složité by bylo hledání příčin mnoha nemocí. Taková studie se nyní používá téměř ve všech lékařských oborech, dokonce i v onkologii. Přestože je pro neinformované obtížné porozumět, v některých případech, po provedení, bylo možné zachránit životy pacientů detekcí nádoru v raných stádiích.

V moderních diagnostických centrech jsou laboratorní vyšetření prezentována nejen pomocí nádorových markerů - jsou pro tuto diagnostiku vybavena působivým arzenálem panelů. S jejich pomocí můžete identifikovat mnoho patologických stavů, jako jsou hormonální abnormality a infekční procesy různého původu..

Kromě toho provedení a dekódování krevního testu ELISA umožní sledovat účinek léků na tělo nemocného nebo dokonce zvířete. Ten je široce používán na veterinárních klinikách, pomáhá udržovat zdraví našich domácích mazlíčků nebo živitelů, zajišťuje stabilní přísun masa, mléčných výrobků a nenahraditelných vajec ve stravě..

V důsledku odběru pouze několika mililitrů žilní krve a její diagnózy pomocí ELISA bude lékař poté, co popsal výzkumné materiály, schopen určit:

  • hormonální stav, včetně biologicky aktivních látek genitálních a štítných žláz, jakož i nadledvin;
  • přítomnost bakteriálních a virových infekcí (hepatitida B a C, syfilis, herpes, chlamydie, tuberkulóza, myko- a ureaplasmóza, HIV, TORCH) a další nemoci tohoto druhu;
  • známky vitální aktivity patogenů patologického procesu, který kulminoval v zotavení a šel do stadia tvorby protilátek (imunitní odpověď).

Tyto komplexy jsou imunitními buňkami mnohem snadněji rozpoznatelné a eliminovány. Zbytkové účinky ve formě protilátek jsou v mnoha případech udržovány v krvi po celý život, což prakticky snižuje riziko reinfekce na nulu.

Typy imunoglobulinů

Existuje několik typů protilátek, z nichž každá je zapojena do procesu imunitní odpovědi v určitém stádiu. Například imunoglobuliny třídy M (IgM) jsou první, kdo reagoval na vniknutí AH do těla. Jejich nejvyšší hodnoty jsou pozorovány v prvních dnech nemoci.

Potom imunitní systém vypouští do plazmy třídu G IG (IgG), která je zodpovědná za úplné zničení antigenů a zotavení pacienta. Později zůstávají v krvi, čímž připravují imunitní systém na opakovanou expozici stejnému patogenu. Podle tohoto principu funguje očkování. Se zavedením atenuovaných antigenů patologických mikroorganismů se v plazmě objevuje mnoho imunoglobulinů a zůstávají v oběhu.

A následně, pokud dojde k patogennímu kontaktu, rychle se s infekcí vypořádají a zachrání tak tělo před ohrožením zdraví. IgA ve velkém množství je koncentrován ve sliznicích, což zabraňuje vstupu patogenních virů a bakterií do těla. IgE jsou zodpovědné za zabíjení parazitárních infekcí a do imunitní odpovědi je zapojeno mnoho dalších imunoglobulinů..

Hlavním předmětem zájmu laboratorní diagnostiky jsou třídy Ig M, G a A. Podle úrovně jejich koncentrace můžete určit stádium nemoci a zjistit, jaké infekční nemoci člověk v životě měl. Můžete například zkontrolovat, zda došlo k historii planých neštovic nebo zarděnek. Aby se zjistilo, zda je v těle pacienta přítomen určitý typ AT nebo AH nebo koncentrace jakéhokoli hormonu, není třeba předepisovat několik laboratorních vyšetření - stačí napsat doporučení pro ELISA.

Podstata metodologie

Enzymaticky vázaný imunosorbentový test na parazity a jiné mikroorganismy, které jsou škodlivé pro zdraví těla, umožňuje nejen stanovit přítomnost patogenů, ale také vypráví o jejich hojnosti v krevní plazmě pacienta. Taková studie tedy umožňuje jak kvalitativní, tak kvantitativní analýzu patogenních mikroorganismů nalezených v materiálu séra..

Hladina koncentrace patogenu významně ovlivňuje vývoj infekce a rychlost zotavení, proto je kvalitativní hodnocení považováno za neméně důležité než kvantitativní. Hraje daleko od poslední role v léčbě dětí a dospělých. Jak je však možné, že IFA dokáže rozpoznat tak širokou škálu mikroorganismů, které parazitují v těle lidí a zvířat, způsobují újmu a snižují kvalitu života?

Metodologie výzkumu je založena na několika možnostech (přímých i nepřímých - konkurenčních a nekonkurenčních) k plnění úkolů, z nichž každá je určena ke konkrétním účelům. Tento přístup umožňuje cílené vyhledávání a v nejkratším možném čase identifikovat příčinu konkrétní patologie. K detekci Ig různých kategorií se používá 96-jamková destička (polystyrenový panel) a sorbované rekombinantní proteiny jsou umístěny v jejích jamkách. Hrají roli antigenů a v počátečním stádiu jsou v pevné fázi.

Při vstupu do díry krevní plazmou antigeny nebo protilátky identifikují objekt v souvislosti s jejich orientací a vytvoří komplex (AG - AT). Tato tvorba je fixována enzymovou sloučeninou (konjugát), která se následně projevuje jako změněné zabarvení díry. ELISA se provádí na specifických zkušebních systémech vyráběných ve specializovaných laboratořích a vybavených celou řadou činidel.

Tuto analýzu lze provést na louse - podložky a čtecí spektrofometry, ale vyžadují manuální práci. Samozřejmě je laboratorní asistent několikrát pohodlnější a rychlejší pro provádění všech manipulací na plně automatizovaných zařízeních. Při jejich používání jsou laboratorní pracovníci osvobozeni od velkého množství monotónní činnosti - mytí, zakopávání a zbytek rutinní činnosti, ale ne všechny lékařské instituce si mohou dovolit takové drahé vybavení

Interpretace výzkumných materiálů je výhradně v kompetenci laboratorního diagnostika - pouze mu lze sdělit výsledky o specifikách a jemnostech průběhu nemoci. V tomto případě musí lékař rozhodně zvážit možnost obdržení falešně negativních nebo falešně pozitivních odpovědí.

Dešifrování materiálu

Výsledkem vysoce kvalitní imunologické diagnózy by měl být jednoznačný závěr - požadovaný mikroorganismus se v tomto vzorku krve nachází nebo ne. Kvantitativní analýza ukáže úroveň koncentrace a může být vyjádřena dvěma způsoby - hodnotou v číslech nebo počtem znaménků „+“.

Analyzované indikátory

V procesu výzkumu důkladná studie hlavních imunoglobulinů zapojených do imunitní odpovědi, jako například:

  • IgM - detekce této třídy znamená vývoj akutní formy infekčního onemocnění. Negativní výsledek hledání IgM může být jak důkazem nepřítomnosti požadovaného patogenu, tak přechodem choroby na chronický průběh.
  • IgA - definice této třídy v nepřítomnosti IgM ve většině případů, signál chronické nebo latentní formy vývoje infekčního onemocnění.
  • IgM a IgA (současná přítomnost) - pozitivní výsledky pro oba druhy ukazují vrchol akutní formy patologie.
  • IgG - jeho přítomnost indikuje přeměnu nemoci na chronickou formu nebo zotavení a vytvoření imunity vůči definovanému činidlu.

Vznik a akumulace určité třídy IG se vyskytuje v různých časových stádiích. Například IgM se objevuje nejprve, přibližně 5 dní po vstupu patogenu. IG jsou v krvi asi 5-6 týdnů a pak postupně mizí. V tuto chvíli jsou k dispozici ke stanovení pomocí ELISA. Přibližně 3–4 týdny po nástupu onemocnění se objeví IgG, který následně může zůstat několik měsíců. Ale v analýze nejsou vždy schopni detekovat.

IgA se tvoří v krvi během 2–4 týdnů, zatímco 20% z nich je obsaženo v séru a 80% je v tajemství sliznic. Tyto imunoglobuliny zpravidla vymizí během 2–9 týdnů, což naznačuje destrukci patogenu a zotavení pacienta. Pokud ELISA stále vykazuje přítomnost IgA, pak to signalizuje přechod procesu do chronické formy.

Možnosti výsledků analýzy

V závislosti na získaných datech mohou být odpovědi ELISA vydávány na formuláři ve formě tabulky s úplným seznamem všech protilátek a hypertenze a indikací pozitivní nebo negativní reakce. V určitých situacích se zobrazí kvantitativní hodnota - ostře pozitivní, pozitivní, slabě pozitivní nebo negativní výsledek. Druhá možnost označuje množství protilátek ve studovaném vzorku krve..

Kromě výše uvedených hodnot je v procesu ELISA studován další kvantitativní parametr - index avidity AT, vypočtený v procentech. Ukazuje, jak dlouho nemoc trvá - to znamená, čím vyšší je indikátor, tím více se patologie vyvíjí..

Alternativní metoda ELISA

Enzymatický imunotest je poměrně dobře známá a běžná diagnóza. Je možné, že někteří o tom nikdy neslyšeli, ale existuje jedna varianta této studie, která je ještě méně známá širokému okruhu lidí, ve kterých je odebrán vzorek krve. Tato technika se nazývá analýza stolice pro okultní krev a v mnoha případech se vyhýbá dalším vysilujícím procedurám, které jsou také doprovázeny nepříjemnými pocity..

Analýza ELISA pro okultní krev (molekuly hemoglobinu) umožňuje detekovat krvácení trávicí soustavy, i když malé, jehož příznaky pouhým okem nelze najít ve stolici pacienta. Enzymaticky vázaný imunosorbentní test okultní krve v lidských výkalech v krátké době může ukázat peptický vřed, polypózu, divertikulózu, nádory, které v raných stádiích nejsou doprovázeny určitými příznaky.

K dnešnímu dni byly vytvořeny tisíce odrůd testovacích systémů pro enzymatický imunotest, které poskytují schopnost najít protilátky a hypertenzi v obrovském seznamu patologií. Tato analýza se proto používá téměř ve všech oborech medicíny pro jakoukoli věkovou kategorii. A absolutní neškodnost vám umožňuje uchýlit se k němu během těhotenství ak diagnostice oslabených pacientů.

Ifa reakce

Imunoanalýza (ELISA)

Imunoanalýza nebo metoda (ELISA) - detekce antigenů pomocí jejich odpovídajících protilátek konjugovaných se značeným enzymem (křenová peroxidáza, beta-galaktosidáza nebo alkalická fosfatáza). Po zkombinování antigenu s enzymem značeným imunním sérem se ke směsi přidá substrát / chromogen. Substrát je štěpen enzymem a mění se barva reakčního produktu - intenzita barvy je přímo úměrná počtu vázaných molekul antigenu a protilátky. ELISA se používá pro diagnostiku virových, bakteriálních a parazitárních chorob, zejména pro diagnostiku salmonelózy, mykoplazmózy atd., Jakož i pro stanovení hormonů, enzymů, léčiv a dalších biologicky aktivních látek obsažených ve zkoušeném materiálu v malých koncentracích - 10 10 - 10 12 g / l.

I. Stanovení protilátek v séru pacienta (v jamkách tablet se sorbovaným antigenem)II. Stanovení antigenu v pacientově séru (v jamkách tablet s adsorbovanými diagnostickými protilátkami)

Konkurenční ELISA pro stanovení protilátek: požadované protilátky a enzymem značené protilátky spolu soutěží o antigeny adsorbované na pevné fázi.

Ifa reakce

Účel lekce. Seznámit studenty s principem metody fluorescenčních protilátek a technikou stanovení imunofluorescenční reakce, s principem a technikou provádění enzymově vázaného imunosorbentového testu.

Vybavení a materiály. Inaktivované kultury brucelly a salmonel, 96% ethanolu, PBS (pH 7,2, 7,4), mokré komory (Petriho misky, exsikátor), luminiscenční sérum proti brucelle, salmonele, králičí imunoglobuliny, pozitivní sérum brucelózy, připravené příprava na demonstraci výsledků ELISA, luminiscenční mikroskop.

Ve výše uvedených sérologických reakcích se používají protilátky (imunitní séra) značená fluorochromem nebo enzymy a následně se za použití zvláštních metod zaznamenává tvorba komplexu antigen-protilátka. V některých provedeních je značka ELISA enzymu zavedena do antigenu.

Metoda fluorescenčních protilátek (MFA). Tato komplexní metoda kombinuje sérologickou reakci, při které dochází ke specifické interakci antigenu a protilátky s tvorbou imunitního komplexu, a mikroskopickým vyšetřením, pomocí kterého je tento komplex detekován..

Při imunofluorescenční reakci se používají protilátky, ke kterým je připojen fluorochrom (častěji je fluorescein isothiocinát). Takové protilátky si zachovávají schopnost specificky reagovat s antigenem a díky fluorochromu září pod vlivem ultrafialových paprsků. Při uvádění MFA je mikrobiální antigen fixován na sklíčku a ošetřen luminiscenčními protilátkami. Poté se lék promyje vodou z nevázaných protilátek a prohlíží se v luminiscenčním mikroskopu. Pokud protilátky specificky odpovídají tomuto antigenu, tvoří s antigenem silný komplex a v luminiscenční mikroskopii se v přípravku nacházejí luminózní mikrobiální buňky (obr. 70)..

Výhodou MFA jako diagnostické metody je to, že s její pomocí je možné sérologicky identifikovat mikroorganismy přímo v patologickém materiálu za dvě až tři hodiny bez izolace v čisté kultuře (expresní metoda). Stejně jako jiné sérologické reakce se MFA používají také k detekci protilátek ve zvířecí krvi..

Příprava léku na MFA. Pokud je na skleněném sklíčku detekován infekční agens (antigen), připraví se nátěry z otisků prstů z orgánů nebo jiného materiálu. K detekci protilátek v testovaném krevním séru se na sklíčku připraví stěr ze známého antigenu, například původce salmonelózy, antraxu atd. Přípravek s naneseným materiálem (bakteriální suspenze, otisk stěr) se suší na vzduchu a fixuje se acetonem (5 minut), nebo ethanol (10, 15 minut) nebo methanol (5, 10 minut). Lék může být také fixován zahříváním, jako v konvenční světelné mikroskopii. Roztěry z orgánů a tkání se nejlépe ošetřují acetonem chlazeným na -20 ° C. 4 min. V závislosti na konkrétních úkolech se barvení hotových přípravků luminiscenčním sérem provádí různými způsoby.

Přímé MFA. Vyvinutý Coons et al. (1950). Kapka luminiscenčního imunitního séra v pracovním ředění obsahujícím protilátky proti požadovanému antigenu se aplikuje na sklíčko s fixovaným antigenem. Aby se zabránilo vysušení, přípravek se umístí do vlhké komory (Petriho miska) s filtračním papírem navlhčeným vodou a udržuje se v termostatu při 37 ° C až 15 minut. Potom léčivo 5. 10 minut promýváno z nevázaných imunoglobulinů tekoucí (tekoucí) vodou s pH alespoň 7,0. Promytý přípravek se suší filtračním papírem a mikroskopicky..

Přímé MFA se používají pouze k identifikaci neznámého antigenu; jeho nevýhodou je potřeba připravit luminiscenční sérum pro každý typ identifikovatelného mikroorganismu.

Nepřímé MFA: Použít ve dvou verzích..

Dvoustupňové MFA byly navrženy Wellerem a Coonsem (1954). Tato možnost je považována za univerzálnější, protože pomocí jediného luminiscenčního antispeciálního séra lze detekovat různé typy mikroorganismů..

K antigenu se aplikuje kapka neznačeného imunitního séra (sérum prvního stupně). Přípravek se udržuje v termostatu 15. 30 minut, poté se promyje, aby se odstranily nenavázané protilátky imunitního séra, a vysuší (viz přímá možnost). Pokud protilátky séra v prvním stádiu odpovídají antigenu, voda nevytvoří vytvořený komplex AG - AT (protilátky jsou na antigenu fixovány).

Kapka luminiscenčního antispeciálního séra (sérum druhé fáze) se aplikuje na vysušený přípravek v pracovním titru. Lék se znovu umístí do termostatu ve vlhké komoře po dobu 15 30 minut, poté se promyje vodou a vysuší. Antidruhové sérum je fluorochromem značená protilátka proti zvířecím krevním imunoglobulinům druhu, ze kterého bylo získáno imunitní sérum v prvním stupni. Protilátky prvního séra tedy slouží jako antigen pro značené protilátky antispeciálního séra. Výsledkem je, že protilátky druhého stádia jsou připojeny k komplexu AG - AT vytvořenému v prvním stádiu, čímž se vytvoří dvojitý komplex, který lze detekovat v luminiscenčním mikroskopu..

Univerzálnost nepřímé možnosti je způsobena skutečností, že v prvním stádiu lze pomocí imunitního séra získaného ze zvířat stejného druhu (například od koní) proti různým mikroorganismům ve druhém stádiu pomocí jediného antidruhového séra identifikovat neomezený počet patogenů infekčních chorob..

Třístupňová MFA je variantou DSC na skle. V tomto případě je v imunitním komplexu na skle pomocí luminiscenčního séra detekován přidružený komplement (Obr. 71).

Použitím dvoustupňového nebo třístupňového MFA pomocí známého antigenu mohou být protilátky detekovány v krvi zvířat.

K potvrzení specifičnosti výsledků makrofinanční pomoci jsou nutné kontroly. Pro přímou variantu stačí jedna kontrola: homologní a heterologní antigenem ošetřené mikroorganismy jsou ošetřeny luminiscenčním sérem. V prvním případě bakterie svítí, ve druhém není záře.

Pro nepřímou možnost se použijí dvě kontroly: 1) nátěry obsahující homologní a antigenně heterologní mikroorganismy se ošetřují antispeciálním luminiscenčním sérem. V nepřítomnosti protilátek v prvním stádiu by buňky neměly luminiscenci; 2) nátěry s homologními a heterologními antigenně bakteriemi se ošetřují imunitním (antimikrobiálním) sérem (první stadium) a následně se aplikuje sérum fluorescenčního antiglobulinového (antispeciálního) (druhé stadium). V prvním případě je pozorována specifická luminiscence bakterií, ve druhém chybí.

Posouzení výsledků MFA. Vezměte v úvahu jas, barvu, lokalizaci a strukturu záře. U bakterií obarvených (ošetřených) luminiscenčním sérem značeným fluorescein izokyanátem je obvykle pozorována jasně zelená záře na periferii buňky ve formě ráfku nebo halo, centrální část bakterie slabě září. Tento charakter záře je vysvětlen skutečností, že několikrát více protilátek je promítnuto z jednotkové oblasti na periferii mikrobiální buňky na sítnici oka pozorovatele než z její centrální části. Je třeba mít na paměti, že v plastických bakteriích (leptospira, vibrace) svítí celá buňka. V buňkách ponořených do tkáňové tekutiny a v mladých antraxových bacilech není kontura obvykle výrazná.

Intenzita záře se odhaduje čtyřcestným systémem: 1) (++++) - velmi jasná fluorescence na okraji mikrobiální buňky, která jasně kontrastuje s tmavou centrální částí buňky; 2) (+++) - jasná fluorescence okraje buňky; 3) (++) - slabá záře periferie buňky; 4) (+) - neexistuje žádná kontrastní záře periferie a centrální části mikrobiální buňky. Absence specifické záře je označena znaménkem mínus (jsou vidět stíny mikroorganismů). V diagnostice různých patogenů chorob je specifická záře bakteriálních buněk považována za pozitivní výsledek ne méně než čtyři nebo tři kříže.

Enzymově vázaný imunosorbentový test (ELISA). Tato metoda získala distribuci po vyřešení úlohy zavedení enzymové značky do molekul protilátek nebo antigenů. Protilátky spojené s enzymem si zachovávají schopnost specificky reagovat s homologním antigenem a enzym interaguje s odpovídajícím substrátem.

ELISA se obvykle používá v histochemických (imunoperoxidázová reakce) a variantách v pevné fázi.

Histochemická ELISA. Při použití této metody se mikrobiální antigeny obvykle nacházejí v nátěrech otisků prstů, krevních nátěrech a histoslices. Stejně jako v případě MPA se peroxidázová reakce používá v přímé a nepřímé verzi.

Přímá imunoperoxidázová reakce. Jako známá složka se používají peroxidázou značené protilátky proti jakýmkoli patogenním mikroorganismům. Přípravek, například otisky prstů, je fixován chlazeným acetonem (-15 až -20 ° C), usušen, čtyři až pět kapek konjugátu se aplikuje v pracovním titru (značené protilátky), inkubuje se ve vlhké komoře při 37 ° C 1,2 hodiny, promyje se fyziologickým roztokem s roztokem 15 minut, opláchnutý destilovanou vodou, vysušený, na přípravek se nanese několik kapek substrátového roztoku (25 mg 3,3-DAB • 4НС1 se rozpustí ve 100 ml 0,05 M Tris pufru s pH 7,5 a 25 ml tohoto roztoku se spojí s 3 ml 0,5% roztoku peroxidu vodíku). Přípravek se substrátem se udržuje po dobu 5,10 minut, promývá se ve fyziologickém roztoku po dobu 10 minut, propláchne se destilovanou vodou a mikroskopicky.

Pokud je v testovaném materiálu přítomen požadovaný mikrobiální antigen, pak se na něj specificky váží protilátky značené peroxidázou. Zavedení substrátu do peroxidázy vede k tvorbě barevného produktu, viditelného pod mikroskopem, nejprve jako modré granule a později žluto-hnědé.

Nepřímá imunoperoxidázová reakce. Stejně jako v MFA se protilátky značené peroxidázou používají pro imunoglobudiny konkrétního živočišného druhu. V první fázi se přípravek s testovaným materiálem fixovaným chlazeným acetonem ošetří ve vlhké komoře při 37,38 ° C 1,2 hodiny imunitním sérem (0,2. 0,3 ml) obsahujícím neznačené protilátky proti požadovanému antigenu. Poté se přípravek promývá fyziologickým roztokem po dobu 5 minut, suší se a ošetří při 37 ° C 38 ° C 1,6 hodiny ve vlhké komoře s protilátkami značenými peroxidázou (konjugát v pracovním ředění). Následující operace a zaznamenávání výsledků jsou podobné přímé variantě peroxidázové reakce.

ELISA na pevné fázi. Aplikujte nejčastěji. V tomto případě jsou protilátky nebo antigeny fixovány na nerozpustných nosičích: mikropanely, skleněné nebo nylonové koule.

Pro různé reakční varianty se výsledky berou v úvahu instrumentálně nebo vizuálně.

Detekce sendvičového antigenu sestává z následujících kroků.

Jamky polystyrénových mikropanelů jsou senzitizovány protilátkami specifickými pro požadovaný antigen [2] v koncentraci 10,30 μg / ml. Typicky je 0,2 ml roztoku protilátky přidáno do jamky v pufru s pH 9,6, udržováno při 37 ° C po dobu 1 hodiny a poté ponecháno přes noc při 4 ° C. Roztok panelových imunoglobulinů je odstraněn a promyt PBS (pH 7,4) třikrát k odstranění přebytku volných (neadsorbovaných) protilátek.

0,2 ml roztoku obsahujícího testovaný antigen se přidá do jamek a inkubuje se při 37 ° C po dobu 2 hodin, pak se panely znovu promyjí, jak bylo popsáno výše.

Do jamek se přidá 0,2 ml specifických protilátek značených enzymem (konjugát); panely se inkubují při 37 ° C 1,2 hodiny, pak se promyjí z nevázaných protilátek.

0,2 ml roztoku enzymového substrátu [ortofenylenediamin (CRF) nebo

Kyselina 5-aminosalicylová - pro peroxidázu a p-nitrofenylfosfát - pro alkalickou fosfatázu] a inkubovaná ve tmě při 20 22 ° C 5 30 minut.

Reakce se zastaví přidáním 0,05 ml 2 N. roztok kyseliny sírové (pro peroxidázu) a 3 M roztok hydroxidu sodného (pro alkalickou fosfatázu).

Výpočet výsledků je vizuální nebo spektrofotometrický pro zvýšení absorpce při vlnové délce 490 nm (peroxidáza) nebo 405 nm (alkalická fosfatáza). Substrát OFD: pozitivní výsledek - oranžovo-hnědé zbarvení. Substrát kyseliny 5-aminosalicylové: pozitivní výsledek - intenzivní hnědá.

Pro pozitivní výsledek se nadbytečná optická hustota experimentálních vzorků nad kontrolou pětkrát až šestkrát.

Detekce protilátek (v krevním séru) je založena na stejném principu, ale nosič v pevné fázi je senzitizován známým antigenem, ošetřen testovacím sérem a poté antiseptickým imunoglobulinem značeným enzymem. Zavede se substrát a barevná reakce se použije k posouzení přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátek v testovaném krevním séru..

ÚKOLY NEZÁVISLÉ PRÁCE

1. Identifikujte přímou MFA kulturu patogenů brucelózy a salmonelózy.

2. Identifikujte dvoustupňovou kultivaci salmonel MFA.

3. Studovat mikroskopický obraz při zohlednění výsledků histochemické ELISA (imunoperoxidázový test).

1. Jaká je podstata jednostupňové, dvoustupňové a třífázové makrofinanční pomoci?

ELISA pro syfilis

Co je ELISA pro syfilis

ELISA pro syfilis - cenově dostupný a vysoce informativní test

ELISA je enzymatický imunosorbentový test, který se používá jako vysoce citlivý test při diagnostice různých patologických stavů, včetně syfilis. Umožňuje vám identifikovat nemoc a určit její stádium co nejpřesněji.

Syfilis vzniká, když bakterie Treponema pallidum (Treponema pallidum) pronikne do těla. Po 2 až 4 týdnech se na lokalizaci, kde došlo k injekci, na kůži vytvoří pevný řev, nejčastěji papula charakteristická pro syfilis na genitáliích, což znamená počáteční fázi primárního syfilis. Jak se nemoc vyvíjí, papuly se transformují na vředy a poté ve většině případů zmizí, což dává pacientovi falešnou naději na samoléčení. Latentní období však přechází do stádia sekundárních syfilis, zatímco treponémy se šíří již v těle a pronikají do tkání a orgánů. Na kůži a sliznicích se tvoří více vyrážky. Při absenci léčby začíná další fáze - terciární syfilis s tvorbou dásní a poškozením centrálního nervového systému, srdce, kostní tkáně, gastrointestinálního traktu, ústní dutiny a dalších orgánů.

Detekce protilátek potvrzuje infekci

ELISA určuje primární, sekundární, terciární (nejčastěji pouze v počáteční fázi), vrozené, recidivující a latentní syfilis. Podstata metody spočívá v detekci protilátek, které tělo produkuje v reakci na zavedení treponému. V počátečním stádiu onemocnění se tvoří protilátky třídy M. Po několika týdnech se k nim připojují imunoglobuliny třídy G. Koncentrace určitých protilátek se liší v závislosti na stadiu vývoje syfilisu, což vám umožňuje určit stádium onemocnění. Při provádění testu ELISA je skutečný treponém bledý nebo jeho antigeny, takže se test týká treponemálních analýz.

Výhody a nevýhody metody

Žádná metoda výzkumu není bez nedostatků.

Dříve byly v diagnostice syfilis použity různé metody, jako například: RPHA (pasivní hemaglutinační reakce), RW (Wassermanova reakce), MR (precipitační mikroreakce), RSK (reakce vázající komplement) a další testy. Různé analýzy, jako jsou screeningové testy a nedostatek sjednoceného systému, často vedly k nejasnostem a v důsledku negativních důsledků, například když se dárce s falešně negativním výsledkem stal prostředníkem v infekci příjemců. Od roku 2006 je testování standardizováno, ELISA byla uznána jako jedna z nejúčinnějších diagnostických metod a v současné době se používá jako ověřovací test, když je zjištěn pozitivní výsledek netreponemální analýzy..

Nontreponemální testy jsou screeningové testy.

Nyní se netreponemální testy používají k identifikaci možné infekce syfilisem ve všech skupinách populace, to znamená, že provádějí screeningové testy. Pokud je výsledek pochybný nebo pozitivní, je předepsána IFA nebo jiná treponemální analýza. ELISA se díky svým výhodám stala jedním z předních testů na syfilis:

  • vysoká citlivost k detekci protilátek proti treponému ve velmi nízké koncentraci;
  • vysoké specificity je dosaženo použitím bledých treponemových antigenů;
  • objektivita výsledků v důsledku automatického účetnictví;
  • snadné nastavení reakce se provádí díky kompletní sadě pro diagnostiku;
  • univerzálnost testu: lze použít k preventivnímu zkoumání populace, k diagnostice všech stádií choroby a ověření pochybných výsledků.

Protilátky proti Treponema pallidum jsou podobné některým typům imunoglobulinů vytvářených během jiných typů infekce, a proto přes specifičnost testu ELISA lze v malých množstvích detekovat falešně pozitivní výsledky. Další nevýhodou testu ELISA je, že s postupujícím onemocněním se počet protilátek snižuje, což může vést k falešně negativním výsledkům..

Indikace studie.

Období těhotenství - indikace pro analýzu

ELISA se provádí jako potvrzující test po nerereponemální analýze, ale může také fungovat jako screeningová analýza. Jmenován v následujících případech:

  • naplánované testování při žádosti o určité typy práce;
  • rutinní identifikace rizika infekce;
  • hospitalizace, předoperační období;
  • dar;
  • těhotenství;
  • screening příznaků syfilis.

Syfilis může být podezřelý specifickým znakem - tvorbou tvrdého chancre, bolestí kloubů a kostí, otokem genitálních orgánů, zvýšením tělesné teploty až o 38 ° C a zvýšením lymfatických uzlin. Jako profylaxe se doporučuje pravidelně absolvovat studii s aktivním sexuálním životem se změnou partnerů.

Příprava ke studiu

Ve febrilním období byste se měli zdržet testu.

Chcete-li minimalizovat riziko získání falešného výsledku, měli byste dodržovat pravidla.

  1. Vzorek krve je podán do prázdného žaludku, v závislosti na laboratoři by doba hladu měla být od 4 do 12 hodin.
  2. Předchozí den nezahrnuje alkohol a mastná jídla, kouření je omezeno nejméně hodinu před studiem.
  3. V předvečer analýzy můžete pít pouze čistou vodu, není dovoleno používat džusy, kávu, drogy.
  4. Všechny ostatní studie a lékařské postupy se provádějí po absolvování testu..
  5. Neměli byste být testováni, pokud se v předchozích dnech vyskytla horečka nebo byla očkována..
  6. Během menstruace se ženám nedoporučuje provádět test..

Rozdělení výsledků

Pozitivní výsledek ukazuje na přítomnost viru

  • přítomnost bledé infekce treponému;
  • falešně pozitivní výsledek v přítomnosti dalších faktorů;
  • účinky dříve ošetřeného syfilis.
  • nedostatek infekce;
  • inkubační (časné primární) období syfilis;
  • pozdní období, včetně pozdních fází vývoje terciárního syfilis.

Falešně pozitivní výsledek a jeho příčiny

Falešně pozitivní test může být na cukrovku

Treponema pallidum je spirochete obsahující 42 genových rodin, z nichž 17% je podobných proteinům jiných typů bakterií, což v malém počtu případů vyvolává pozitivní výsledek v přítomnosti infekce jinými mikroorganismy. Například u řady autoimunitních onemocnění jsou detekovány antifosfolipidové protilátky podobné těm, které se vyskytují u syfilis. Na přelomu 21. století bylo zjištěno, že v tomto případě je rozdíl mezi protilátkami závislým faktorem, u autoimunitních onemocnění jsou protilátky závislé na p2-glykoproteinu-1 a v syfilisech nejsou závislé. Dosud však zůstává otázka výskytu falešných pozitivních reakcí otevřená, protože důvod těchto výsledků není vždy jasný.

Podle statistik se nejčastěji falešně pozitivní výsledky projevují v následujících případech:

  • hepatitida;
  • malomocenství;
  • infarkt myokardu;
  • opojení;
  • onemocnění pojivové tkáně;
  • autoimunitní patologie;
  • diabetes;
  • těhotenství;
  • menstruační období;
  • období po vakcinaci.

Treponema má podobnost s jinými patogeny

Treponema pallidum není jediným druhem trepanem, k patogenním patogenům patří i další spirochety: Treponema pertenue (původce javy), Treponema bejel (původce paty), Treponema carateum (původce pinty) a mnoho dalších. Při mikroskopickém vyšetření se liší jen málo od bledého treponému a protilátky proti nim jsou podobné jako imunoglobuliny u syfilis.

Pozitivní výsledek může odrážet přítomnost onemocnění v minulosti, protože imunoglobuliny třídy G jsou schopné zůstat v krevním oběhu roky.

Falešně negativní výsledek a jeho příčiny.

V inkubační době může být výsledek negativní

V počátečním stádiu nemoci ELISA vykazuje negativní výsledek, toto období je inkubace, kdy primární syfilis dosud nedorazil a neexistují žádné charakteristické znaky nemoci. Inkubační doba ve srovnání s údaji o infekci syfilisem v polovině 20. století se zvýšila o 7-10 dní, v současné době je to asi 3 týdny. To znamená, že po průniku treponému do těla bude detekován falešně negativní výsledek po dobu 3 a někdy i více týdnů.

Při absenci terapie se terciární syfilis obvykle vyvíjí po 3 až 5 letech od okamžiku infekce, v některých případech se onemocnění může projevit po 10 až 15 letech na pozadí asymptomatického průběhu a přechodu syfilis z jednoho stadia do druhého. Do této doby je počet protilátek významně snížen nebo zcela chybí, což vede k falešně negativním výsledkům. Podle některých zpráv mohou různá infekční onemocnění, diabetes mellitus a použití určitých antibiotik ovlivnit nesprávný falešný výsledek..

Top